一、技術(shù)原理與生物學(xué)基礎(chǔ)

1. 電穿孔的物理機(jī)制

• 膜電位改變：短時高壓電場（通常500–4000 V/cm）使細(xì)胞膜磷脂雙層發(fā)生極化，形成親水性臨時孔隙（直徑≈10 nm），持續(xù)時間毫秒級。

• 分子遞送機(jī)制：帶負(fù)電的DNA/RNA在電場驅(qū)動下以電泳方式穿過孔隙進(jìn)入胞質(zhì)，后續(xù)依賴細(xì)胞自身機(jī)制擴(kuò)散至核內(nèi)（核膜無有效電場作用，故“核電轉(zhuǎn)"為偽概念）。

• 可逆性與安全性：

• 可逆電穿孔：低強(qiáng)度脈沖后膜修復(fù)完整，細(xì)胞存活率>90%。

• 不可逆電穿孔：高強(qiáng)度脈沖致膜結(jié)構(gòu)yong久破壞，用于腫瘤消融（非基因操作）。

2. 關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

注：物種差異性顯著，如小鼠受精卵需30V脈沖（3ms時長+97ms間隔，7循環(huán)）。

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

1. 體外電轉(zhuǎn)（以受精卵為例）

1. 樣本制備：

• 收集受精卵（體內(nèi)/體外受精），用低鹽緩沖液（如Opti-MEM）清洗3次，去除血清干擾。

2. 電轉(zhuǎn)體系構(gòu)建：

• 將受精卵與目標(biāo)分子（如CRISPR/Cas9核糖核蛋白）混合，置于電轉(zhuǎn)杯或定制電極槽（如LF501PT1-10鉑金電極）。

3. 脈沖施加：

• 優(yōu)化參數(shù)（如小鼠：30V，3ms脈沖×7循環(huán)），脈沖間隔97ms避免過熱。

4. 復(fù)蘇培養(yǎng)：

• 電轉(zhuǎn)后立即用M2培養(yǎng)基清洗，轉(zhuǎn)入KSOM培養(yǎng)液恢復(fù)，37℃/5% CO?孵育至囊胚期。

2. 體內(nèi)電轉(zhuǎn)革新：i-GONAD技術(shù)

• 原理：跳過體外操作，直接對孕鼠輸卵管壺腹部施加電場，轉(zhuǎn)染體內(nèi)受精卵。

• 流程：

1. 孕鼠麻醉后暴露輸卵管。

2. 注入外源DNA溶液至壺腹部。

3. 定制電極夾住輸卵管施放電脈沖（參數(shù)同體外）。

• 優(yōu)勢：

• 避免體外培養(yǎng)損傷，胚胎存活率提升20%。

• 已成功應(yīng)用于小鼠、大鼠，潛力擴(kuò)展至豬、猴。